1.改良乳汁品質(zhì);

　　2.生產(chǎn)藥用蛋白。

　　3.外源基因在動(dòng)物體內(nèi)的位點(diǎn)整合問(wèn)題;

　　4.乳蛋白基因表達(dá)組織特異性問(wèn)題;

　　5.目的蛋白的翻譯后修飾問(wèn)題;

　　6.轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化問(wèn)題;

　　7.轉(zhuǎn)基因的技術(shù)與方法問(wèn)題;

　　8.倫理道德問(wèn)題。

　　膀胱生物反應(yīng)器

　　膀胱反應(yīng)器有著和乳腺反應(yīng)器一樣的優(yōu)點(diǎn)：收集產(chǎn)物蛋白比較容易，不必對(duì)動(dòng)物造成傷害。此外，該系統(tǒng)可從動(dòng)物一出生就收集產(chǎn)物，不論動(dòng)物的性別和是否正處于生殖期。膀胱生物反應(yīng)器 *顯著的優(yōu)勢(shì)在于從尿中提取蛋白質(zhì)比在乳汁中提取簡(jiǎn)便、高效。

　　膀胱生物反應(yīng)器多用Uroplakin啟動(dòng)子啟動(dòng)人生長(zhǎng)激素(hGH)的表達(dá)，產(chǎn)生 hGH特異性的高豐度RNA，這些RNA與蛋白分泌量高度相關(guān)。Uroplakin基因在多種哺乳動(dòng)物體內(nèi)有很高的保守性，如鼠、兔、牛、羊和人等。

　　生長(zhǎng)激素 Kerr等[12]將pUPII-LacI用質(zhì)粒的Kpn i進(jìn)行消化，用T4DNA多聚酶切去3'端，然后用BamHI消化，分離出3.6kb的5'端小鼠UPII基因片段，此片段含有膀胱反應(yīng)器特異性表達(dá)所需的大部分序列。將此片段與位于無(wú)啟動(dòng)子的pOGH質(zhì)粒純化SaI和BamHI位點(diǎn)間的hGH結(jié)構(gòu)基因的5'端連接，得到pUPII-hGH質(zhì)粒，能表達(dá)該質(zhì)粒的組織分布有限。將得到的pUPII- hGH質(zhì)粒用HindIII和EcoRI消化，得出一段5.7kb的UPII-hGH融合基因可用于顯微注射，在膀胱上皮細(xì)胞中合成hGH，收集轉(zhuǎn)基因動(dòng)物尿液，從中提取重組蛋白。但在這一途徑中轉(zhuǎn)基因動(dòng)物會(huì)因hGH的作用逐漸肥胖，并導(dǎo)致雌性動(dòng)物不育癥。乳腺生物反應(yīng)器也能表達(dá)hGH。用同源重組方法將hGH基因?qū)?10kb的人α-乳球蛋白位置依賴(lài)性YAC載體，將重組的YAC dNA顯微注入大鼠胚胎，轉(zhuǎn)基因大鼠的乳汁中含有高水平的hGH，含量可達(dá)0.25～8.9mg/ml[13]。

　　翻譯與修飾

　　轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分泌的蛋白，特別是糖鏈成分的結(jié)構(gòu)與人體蛋白有差異。因此研究分泌蛋白的修飾就顯得很重要。在乳腺生物反應(yīng)器中，蛋白質(zhì)翻譯前修飾的主要方式是在多個(gè)位點(diǎn)對(duì)乳腺中的蛋白前體進(jìn)行信號(hào)肽剪切和對(duì)糖鏈進(jìn)行修飾。例如，從山羊乳液中得到的長(zhǎng)效組織型纖溶酶原激活劑與人體內(nèi)和相比較，含有少量的異種(外源)低聚糖，同時(shí)，唾液酸、N-乙酰葡萄糖胺和半乳糖含量明顯減少，關(guān)且出現(xiàn)缺少蛋白質(zhì)C127的N-乙酰半乳糖胺。此外，從豬乳液中得到的C蛋白中是沒(méi)有的;從羊乳液中得到的重組α1-抗胰蛋白酶多聚肽也反映了唾液酸酸化程度的差異;在山羊乳腺中觀察到了重組抗凝血酶Ⅲ上低聚甘露糖與特異天冬酰胺的位點(diǎn)特異性聚合等等。研究小鼠乳液中的重組γ-干擾素可對(duì)翻譯前修飾有更好的理解，γ-干擾素有大量的位點(diǎn)特異性變化，在N端連接位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)雜的唾液酸酸化和連接核心巖藻多聚糖，其次是低聚甘露糖。與從小鼠細(xì)胞中取得的蛋白質(zhì)相比，分泌的重組蛋白沒(méi)有GalNAc、NeuGC和Gal∞l 、3Gal-βl、 4GlcNAc殘基。這些蛋白特異性的糖基化類(lèi)型可與細(xì)胞上的受體結(jié)合并清除病人體內(nèi)的重組蛋白，因此可能會(huì)影響療效， *終的結(jié)果尚有待驗(yàn)證。

　　同源組織表達(dá)蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是可對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行調(diào)控并校正珠蛋白鏈的翻譯過(guò)程，避免無(wú)效的翻譯前修飾，使產(chǎn)物蛋白盡可能與人體天然蛋白相似，降低人體內(nèi)的排斥反應(yīng)，提高藥物蛋白療效。目前，蛋白分離技術(shù)飛速發(fā)展，大大提高了蛋白質(zhì)分離的可行性和分離效率。第二種技術(shù)路線中目前以乳腺生物反應(yīng)器較為多見(jiàn)，因?yàn)槿橹椎玫?，且乳汁中的特異蛋白含量較大，對(duì)蛋白水解酶的降解作用也比較穩(wěn)定。乳汁是一種混合物，含3%～6%的總蛋白，3%～5%的脂類(lèi)，對(duì)蛋白提純技術(shù)要求比較高。另一方面，藥用蛋白是在動(dòng)物乳腺中產(chǎn)生。因此只有含轉(zhuǎn)基因型人雌性動(dòng)物在泌乳期才能生產(chǎn)藥用蛋白，可用的動(dòng)物數(shù)目有限，且生產(chǎn)期較短。膀胱生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)在于含有轉(zhuǎn)基因型的兩性動(dòng)物都可用，產(chǎn)后收集時(shí)間長(zhǎng)，提取產(chǎn)物蛋白濃度雙乳液中的含量低得多，盡管收集的尿液多且時(shí)間長(zhǎng)，生產(chǎn)單位數(shù)量的藥用蛋白在乳腺和膀胱生物反應(yīng)器中的成本是差不多的

　　問(wèn)題與展望

　　在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的應(yīng)用中，有些問(wèn)題尚待解決。比如，由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因是鑲嵌整合型的，因此它的下一代并不都轉(zhuǎn)基因型。但是在綿羊，豬和山羊中觀察到只要轉(zhuǎn)基因型從起始個(gè)體傳給了下一代，這種轉(zhuǎn)基因型就可以穩(wěn)定地遺傳好幾代。而其他一些因素，如外源基因的整合率低，胚胎移植的受孕率低等都使有效的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物大大減少。同時(shí)，由于對(duì)調(diào)控表達(dá)水平的程序，指導(dǎo)進(jìn)行 的組織特異性和發(fā)育調(diào)控表達(dá)的程序，以及調(diào)控和編碼內(nèi)含子序列間可能的相互作用的認(rèn)識(shí)尚不充分[14]，容易引起異位點(diǎn)表達(dá);由于現(xiàn)在的技術(shù)還不能控制整合的位點(diǎn)，因此存在對(duì)內(nèi)源基因進(jìn)行插入誘變的可能性，轉(zhuǎn)基因型的表達(dá)會(huì)受整合的不同位點(diǎn)的影響。這些因素使得在家畜長(zhǎng)成前，要用小鼠對(duì)新基因構(gòu)型進(jìn)行常規(guī)試驗(yàn)。

　　轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的藥用蛋白可用于預(yù)防和治療疾病，其轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及口服用藥引起的耐受性等問(wèn)題都在作進(jìn)一步研究。以轉(zhuǎn)基因家畜生產(chǎn)珍貴的藥用蛋白具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益，這項(xiàng)生物技術(shù) *終將會(huì)得到廣泛應(yīng)用。